反相色譜是迄今在高效液相色譜中應(yīng)用*廣泛的技術(shù)，主要是因?yàn)樗m用于分析極大多數(shù)的非極性物質(zhì)和很多的可離子化的及離子化合物。大多數(shù)用于反相色譜的固定相本質(zhì)上都是疏水物質(zhì)，因此，分析物是按照它們與固定相的疏水相互作用的大小程度來分離的，樣品基體中其它疏水雜質(zhì)組分也能以同樣的方式保留。

　　反相色譜柱是一種常用的色譜柱產(chǎn)品，主要由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成，被廣泛用于多個(gè)領(lǐng)域中。在反相色譜柱的使用中，保持色譜柱的柱效、容量和滲透特性，延長柱子的使用壽命非常重要。使用時(shí)間后就會(huì)出現(xiàn)柱壓升高、柱效降低、峰形畸變和分離度降低、保留時(shí)間改變等變化，如不采取措施，將會(huì)縮短色譜柱的使用壽命，影響工作效率，并造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。

　　有哪些因素會(huì)影響到反相色譜柱呢？

　　(1)柱長

　　有機(jī)小分子和肽類的分辨率隨柱長的增加而增加．但是柱長增加并不能使蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率顯著增加．它們?cè)谳^短的柱子上往往也有很好的分離效果。

　　(2)流動(dòng)相的流速。

　　有機(jī)小分子和肽類的分辨率對(duì)流動(dòng)相流速非常敏感。而蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率則不然。流速越小，柱子越長，色譜峰的寬度就越大，分辨率就越小。制備色譜上樣過程中的流速對(duì)動(dòng)態(tài)吸附容量影響很大。

　　(3)溫度。

　　溫度上升，流動(dòng)相黏度下降，流動(dòng)速度加快，且流動(dòng)相與固定相之間的傳質(zhì)速度加快，使分辨率增加。同時(shí)，溫度上升，分子熱運(yùn)動(dòng)增加，疏水性作用減弱。升高溫度要考慮目標(biāo)物質(zhì)的熱穩(wěn)定性。

　　(4)流動(dòng)相組成。

　　流動(dòng)相的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大，洗脫時(shí)間越短。RPC多采用降低流動(dòng)相極性(水含量)的線性梯度洗脫法。水是極性zui強(qiáng)的溶劑，在反相色譜中常常和基礎(chǔ)溶劑配合使用，向流動(dòng)相中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機(jī)溶劑，以得到不同強(qiáng)度的流動(dòng)相，這些有機(jī)溶劑稱為修飾劑。反相色譜中zui常用的有機(jī)溶劑有甲醇和乙腈。此外，乙醇、四氫呋喃、異丙醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑。有機(jī)溶劑梯度的大小也會(huì)影響分辨率，一般梯度越小．分辨率越大。